活性炭

臭氧一生物活性炭中试系统微生物菌群分析

摘要：通过经典的微生物分离培养方法和微生物自动鉴定系统，结合16SrDNA序列分析，对正在运行的臭氧—生物活性炭中试系统中生物活性炭附着的生物膜进行了微生物酶群分析，结果表明生物活性炭生物膜上的微生物主要由细菌组成，未发现藻类、放线菌、小型丝状真菌和原生动物，未检测出水体中常见的致病菌如沙门氏菌、铜绿假单胞菌、副溶血性弧菌、人肠杆菌0157和志贺氏菌。其中细菌又以革兰氏阴性苗为主，带有部分的芽孢杆菌。铁细菌和硝化细菌数量均处于较低水平(小厂1000cells/mL(g))。共分离鉴定了4株酵母菌和产吲哚金黄杆菌Chryseobacterium indologenes、粘液威克斯氏菌Weeksella Virosa、泡囊短波单胞菌Brevundimonasvesicularis和敏捷食酸菌Acidovorax．加cilis等17个属的32株细菌，从上层炭和中层炭生物膜上分离的细菌主要类群基本相同，但随降雨量的变化会有所改变。大部分分离的细菌为环境水体和土壤中常见的细菌，因此BAC上生物膜对水中微生物安全不构成威胁，但应注意从BAC炭滤池中泄漏的细菌可能影响出水中的微生物指标，后续的消毒处理显得非常重要。

关键词：饮用水，生物活性炭，微生物苗群

随着环境污染日益加剧，饮用水安全问题引起世界各国的普遍关注。近年来国内外在探讨饮用水处理新工艺方面开展了大量的下作，已将各种材料应用于水处理研究领域以寻求更有效的方法来提高饮用水的卫生和质量。如活性炭代替砂滤直接吸附、单一的臭氧化技术、臭氧一一砂滤联用技术、活性炭一一砂滤联用技术、生物活性炭一一砂滤联用技术、臭氧——生物活性炭联合工艺(简称03—BAC)等。其中03—BAC净化工艺以其高效去除水中溶解性有机物和致突变物，出水安全、优质而备受关注。该工艺于20世纪60年代中期在德国Dusseldorf水处理厂首先采用，目前被欧美等发达国家广泛应用到水的深度处理中，对净化饮用水中各种污染物取得了良好的效果。我国于20世纪80年代开始应用该项技术，并相继建成了一批应用该技术的深度处理水厂，取得了较好的处理效果。

    但是，由于03—BAC净化工艺中自然形成BAC时间长，无选择性，生物相复杂，对其生物膜形成的适宜生长条件、驯化优势微生物菌群以及其对出水水质的影响了解不多，且BAC上附着的微生物及其代谢产物本身进入水体中的安全性国内未见相关文献报道。因此，本研究以运行中的BAC为材料，对其微生物菌群进行系统分析和研究，以便为03—BAC的有效运行和工艺参数的确定提供重要的理论依据。

1材料与方法

1.1样品采集与处理

    在运行一年多的03—BAC中试系统中，从2005年5月至9月，共采样3次，分别采集进炭池水、BAC滤池出水、反冲洗前段后段水各250mL，以及BAC滤池深度为2—4cm、45—50cm的活性炭样各50g，4小时内进行测试。

水样直接进行微生物分离培养，BAc炭样采用4种方法进行生物膜上微生物的洗脱：分别称取5g湿炭，(1)加100mL 2.8g/l灭菌焦磷酸钠，200r/min振荡30min，(2)加100mL2.8g/L灭菌焦磷酸钠，用KQ-500DB型数控超声波清洗器(频率50％，功率40％)处理6min，(3)加100mLl.4g/l焦磷酸钠，同上超声波处理6min，(4)加100ml灭菌纯水，同上超声波处理6min。洗脱液用相差显微镜观察BAc上微生物类群，同时用灭菌生理盐水依次稀释后进行微生物分离培养。

1．2微生物分离培养

(1)腐生菌(异养苗)、放线菌、小型真菌分别用R2A琼脂培养基、改良高氏一号琼脂培养基和DRBC琼脂培养基，倾注平板法，260C培养7天。

(2)硝化细菌、铁细菌分别用Winvgradsky's培养基和柠檬酸业铁铵培养基，测试其MPN值(最大可能数)，26~C培养7—14天[4]。

(3)酵母菌富集培养：取洗脱原液10mL加入100mL乳酸马铃薯葡萄糖培养液中，260C培养3～7天，变浑浊，产生菌膜或沉淀，显微镜观察，再分离。

(4)致病菌检测：参照标准方法检测水样和BAC洗脱液中的沙门氏菌、铜绿假单胞菌、副溶血性弧菌、大肠杆菌O157和志贺氏菌。

挑取平板上生长的不同菌落进行分离纯化，得到纯菌株作下一步的鉴定。

1.3菌株生化鉴定

分离纯化的曲株经革兰氏染色显微镜观察和触酶、氧化酶、OF等简单的生化试验后选择合适的法国生物梅里埃APl生化鉴定系统或Biolog生化鉴定系统进行鉴定。

1.4细菌16SrDNA鉴定

    菌株染色体DNA采用煮沸法或SDS-蛋白酶K裂解法提取，16SrDNA扩增引物为细菌16SrDNA通用引物F25(5’—AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和R1522(5’-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’)。PCR扩增体系总体积为50uL：超纯水34.5uL，10XBuffer5uL，2.5mmoL/LdNTPluL，10u moL/L primer各1uL，25mmoL／LMgcl25uL，5u/uL rTaq酶0.5uL，模板DNA稀释至适当浓度后取2uL。同时以去离子水模板DNA做—空白对照。PCR条件为：95℃ 5min;  95℃ lmin，54℃ lmin，72℃ 3min，进行30个循环；72min 7min。1.5kb的PCR扩增片段经琼脂糖电泳检测纯化后直接送基因公司测序。测序结果用Blast程序在GenBank网站上进行相似性搜索，选取同源性最高和最有代表性的菌株作为16SrDNA序列分析的最终结果。

2结果与讨论

2.1 BAC上生物膜洗脱效果比较

采刚4种生物膜洗脱方法，洗脱液适当稀释后用R2A琼脂培养基倾注平板法，26'C培养7天，洗脱效果如表1所示。结果表明BAC在2.8g/L灭菌焦磷酸钠中 200r/min振荡30mi  的洗脱效果最差，超声波处理6min的菌落数是它的十倍。有人认为焦磷酸钠对细菌细胞有轻微的毒害作用，但短时间处理添加与否对结果没有影响，因此，在样品处理时，选用超声波处理的方法可以达到理想的洗脱效果且不影响微生物的分离培养。

表1 不同生物膜洗脱方法结果

2.2微生物分离培养结果

在相差显微镜下观察BAC生物膜洗脱液，发现主要是细菌承和一些杂质，未发现藻类、型真菌和原生动物。各类微生物分离培养结果表明，细菌是BAC生物膜的主要组分(异养菌的数量达到2.56×106～1.17×107cfu/g，见表2)，未分离到放线菌和小型丝状真菌，仅从反冲洗水样中分离到4株酵母菌，且未检测出水体中常见的致病菌如沙门氏菌、铜绿假单胞菌、副溶血性弧菌、大肠杆菌O157和志贺氏菌。其中细菌又以革兰氏阴性杆菌为主，带有部分的芽孢杆菌。测试铁细菌的数量小于1000cells/mL(g)，这可能与原水的水质有关，因原水是二类地表水饮用水水源，Fe、Mn含量不高，因此不适于铁、锰氧化细菌的生长。硝化细菌(包括亚硝化细菌和硝化细菌)的数量亦处于较低水平(同样小于1000 cells/mL(g)，见表3)。

表2 异养菌数量测试结果

2.3菌株鉴定结果

挑取平板上主要的菌落分离纯化后进行生化鉴定和细菌16SrDNA序列分析，结果如表4-1、4-2所示，共分离鉴定了4株酵母菌和17个属的32株细菌。细菌属包括金黄杆菌属

Chryseobacterium、威克斯氏菌属Weeksella、短波单胞菌属Brevundimonas、肠杆菌属Enterobacter、黄色单胞菌属Flavimonas、丛毛单胞菌属Comamonas、食酸菌属Acidovorax、

短杆菌属Brevibacterium、黄杆菌属Flavobacterium、巴斯德氏菌属Pasteurella、气单胞菌属Aeromonas，鞘氨醇单胞菌属Sphingomonas、沙雷氏菌属  Serratia、色杆菌属Chromobacterium、泛菌届Pantoea、变形杆菌属Proteus、芽孢杆菌属Bacillus。第一、二次采样天气状况如气温、降水量等较为稳定，降雨较少，故微生物分离鉴定结果相似，但第三次采样是雨季，降雨量大，原水浊度大大增加，细菌的类群有所增加。总的来说，上层炭和十层炭上细菌的主要类群基本相同。但反冲洗水样中微生物的类群更为丰富，推测是BAC反冲洗使不同深度的生物膜脱离并混合从而增加了微生物的种类。从炭后水中分离的细菌主要类群基本与炭上或反冲洗水样中相同。大部分细菌为环境水体和土壤中常见的细菌，分离到的4株酵母菌同样不是人致病菌。值得注意的是，从BAC炭滤池中泄漏的细菌可能导致出水中异养苗的增加并有利于条件致病菌的生长，因此后续的消毒处理仍然非常重要。

表3   铁细菌、硝化细菌测试结果

表4-1酵母菌菌株鉴定结果

 表4-2 细菌菌株鉴定结果

    BAC生物膜上微生物主要由细菌组成，未发现藻类、放线菌、小型丝状真菌和原生动物，未检测山水体中常见的致病菌如沙门氏菌、铜绿假单胞菌、副溶血性弧菌、大肠杆菌O157和志贺氏菌。其中细菌又以革兰氏阴性杆菌为主，带有部分的芽孢杆菌。铁细菌和销化细菌数量均处于较低水平(小于1000cells／mL(g))。共分离鉴定了4株酵母菌和17个32株细菌，细菌属包括金黄杆菌属Chryseobacterium、威克斯氏菌属Weeksella，短波单胞菌属Brevundimonas，肠杆菌属Enterobacter、黄色单胞菌属Flavimonas、丛毛单肛Comamonas、食酸菌属Acidovorax、短杆菌属Brevibacterium、黄杆菌属Flavobacterium、巴斯德氏菌属Pasteurella、气单胞菌属Aeromonas、鞘氨醇单胞菌属Sphingomonas，沙雷氏属Serratia，色杆菌属Chromobacterium、泛菌属Pantoea、变形杆菌属Proteus，芽孢属Bacillus。从上层炭和中层炭生物膜上分离的细菌主要类群基本相同，但随降雨量的变化会有所改变，大部分分离的细菌为环境水体和土壤中常见的细菌，因此BAC上生物膜中微生物安全不构成威胁，但应注意从BAC炭滤池中泄漏的细菌对出水中微生物的影响，后续的消毒处理显得非常重要。仅从反冲洗水样中分离到酵母菌，提示小型真菌可能存在于更深层的炭中，由于采样工具的局限性，未能了解深层BAC上微生物的情况。同时研究中获得的纯培养微生物只占实际存在微生物的一小部分，传统纯培养研究方法对环境微生物多样性所得到的结果只能部分代表自然环境微生物群落的组成与结构，因此，采用分子生物学方法如变性梯度凝胶电泳(DGGE)、荧光原位杂交等免培养方法研究BAC上微生物的分布、群落时空动态变化将是本研究下一步的重点。
 

作者：张菊梅  吴清平  李程思  郭伟鹏